بررسی فعالیت آنزیم کاتکول 2،3دی اکسیژناز در باکتری های جدا شده از خاک های آلوده به نفت خام- قاسم حیدری؛ اکبر قویدل؛ نیراعظم خوش خلق سیما؛ علی عبادی؛ فرشاد علیشاهی- مرکز مهندسی عطران

0

نفت خام یکی از مهمترین نهاده‌ها در صنایع انرژی و شیمیایی است که با توجه به رسوبات طبیعی و انتشار گسترده گازهای سمی حاصل از آن، یکی از شایع ترین آلاینده­های آلی برای محیط زیست به حساب می­آید.

پالایش زیستی منابع آلوده به ترکیبات نفتی راهکاری مناسب برای پاکسازی این منابع می­باشد که در این فرآیند میکروارگانیسم­ها و به ویژه باکتری­ها در تجزیه ترکیبات هیدروکربنی نقش کلیدی ایفا می­کنند.

ترکیبات هیدروکربنی دارای اجزای مختلفی هستند که ترکیبات آروماتیك از فراوانترین آن­ها هستند و توسط آنزیم­های دی­اکسیژناز تخریب می­شوند. در مطالعه حاضر 10 جدایه از بین جدایه­های بدست آمده از خاک­های آلوده به نفت خام انتخاب شدند.

میزان فعالیت آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز بعد از اندازه گیری میزان توانایی تولید بیوسورفکتانت مورد بررسی قرار گرفت. بررسی­های انجام شده نشان داد که جدایه­های T16 و B3 دارای آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز هستند که این جدایه­ها توانایی بالایی در امولوسیون کنندگی و در مقابل توانایی کمتری در پخش نفت و پاشش قطره  از خود نشان دادند.

در ضمن نتایج آزمایش امولوسیون کنندگی با میزان فعالیت کاتکول 2،3دی­اکسیژناز تا حدودی شباهت معنی داری، اما با نتایج آزمایش­های پخش نفت و پاشش قطره اختلاف معنی داری دارند.

  • مقدمه

نفت خام یکی از مهمترین نهاده‌ها در صنایع انرژی و شیمیایی است که با توجه به رسوبات طبیعی و انتشار گسترده گازهای سمی حاصل از آن، یکی از شایع ترین آلاینده­های آلی برای محیط زیست به حساب می­آید که عمدتا از منابع طبیعی و فعالیت­های انسانی ناشی می­شود و به طور قابل توجهی برای محیط زیست زیان­آور است (Wang و همکاران، 2013).

با وجود اينکه در اغلب نقاط دنيا تمهیدات موثري به منظور جلوگيري از ورود مواد نفتي به محیط به عمل آمده است، اما متاسفانه آلودگي اتفاقي ناشي از اين مواد غیر قابل پرهيز است. بروز این آلودگی­ها سبب اختلال در نظام طبیعی اکوسیستم­های مختلف از جمله خاک و آب مي‌گردد.

   فرايندهاي فيزيكي و شيميايي بسياري براي پالایش مكان­هاي آلوده به ترکیبات هیدروکربنی مورد استفاده قرار می­گیرد، اما متاسفانه روش­هاي موجود هر يك داراي مشكلاتي مي­باشند كه استفاده از آنها را محدود به شرايط خاصي مي­نمايد (Sohi و همکاران، 2010).

در مقابل، در روش­های بیولوژیکی از موجودات زنده برای حذف آلاینده­ها از منابع آلوده استفاده می­شود. با توجه به هزینه پایین، عملکرد بالا و مطابقت با اصول زیست محیطی، روش زیستی در بین روش­های دیگر پالایش آلودگی، بیشتر مورد توجه قرارگرفته است.

ریزجانداران، به ویژه باکتری­ها، نقش مهمی را در این روش ایفا می­کنند. توانایی باکتری­های مختلف در تجزیه اجزاء هیدروکربنی نفت خام به اثبات رسیده است و پالایش زیستی بر پایه ریزجانداران به عنوان روشی موثر در پاک­سازی ترکیبات نفتی از محیط­های مختلف گزارش شده است (Wang و همکاران، 2013).

وارد کردن باکتری به یک خاک آلوده که غالبا با تحریک زیستی همراه است را زیست افزایی می­نامند. افزودن ریزجانداران غیربومی یا کشت شده به محیط­های طبیعی یا مصنوعی مفهوم جدیدی نیست و پیش­تر در کشاورزی، فرآیندهای تیمار هرزآب و پالایش زیستی مکان­های آلوده استفاده شده است.

فرآیند تجزیه هیدروکربن­ها در خاک توسط ریزجانداران مختلفی انجام می­گیرد، اما تعداد کمی از آنها هیدروکربن­ها را به عنوان منبع کربن و انرژی مورد استفاده قرار می­دهند. به طور کلی این باور وجود دارد که باید گونه­های باکتری فعال در تجزیه هیدروکربن جداسازی شده و بعد از کشت،

به صورت مایه تلقیح در خاک آلوده استفاده شوند. به طور معمول عمل زیست افزایی از طریق کاربرد مکرر باکتری­های توانمند در تجزیه آلاینده و با انتخاب سویه مناسب با توجه به ترکیب آلاینده و شرایط محیطی خاص، موفقیت آمیز خواهد بود (Li و همکاران، 2016).

ترکیبات هیدروکربنی دارای اجزای مختلفی هستند که رتبه بندی آن­ها برای تجزیه زیستی به صورت آلکان­های خطی> آلکان­های شاخه­دار> آروماتیک­های کوچک> آلکان­های حلقوی است (Atlas و Bragg ، 2009).

ترکیبات آروماتیك از فراوانترین هیدروکربن­های مشاهده شده در نفت خام و محصولات حاصل از از آن هستند (Haritash و Kaushik، 2009). آروماتیک­های حلقوی توسط آنزیم­های دی­اکسیژناز تخریب می­شوند. در بین این آنزیم­ها، آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز در تخریب آروماتیک­های حلقوی نقش بسزایی دارند (Guo و همکاران، 2015).

بنابراین هدف از مطالعه حاضر تعیین میزان فعالیت آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژنازدر باکتری­های جداسازی شده از خاک­های آلوده به نفت­خام و بررسی ارتباط بین فعالیت آنزیم با میزان توانایی تولید بیوسورفکتانت توسط جدایه­های مختلف بود.

  • مواد و روش

در این تحقیق به منظور جداسازی جامعه میکروبی تجزیه کننده نفت­، خاک­های آلوده به نفت­ خام از 4 نقطه واقع در پالایشگاه­ نفت شهید تندگویان شهر ری، پالایشگاه­ نفت امام خمینی شازند، پالایشگاه­ نفت بندرعباس و پالایشگاه­ نفت اصفهان از عمق 30-0 سانتی­متری سطح خاک که در اثر فعالیت­های پالایشی و ذخیره­سازی نفت­خام آلوده و در طول چند سال اخیر دچار هوازدگی شده بودند،

نمونه­برداری و در ظروف حاوی یخ (4درجه سانتی­گراد) به آزمایشگاه بخش فیزیولوژی مولکولی پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی (ABRII) انتقال داده شدند. بعد از غنی­سازی باکتری­ها با محیط کشت معدنی BHB[1] حاوی نفت­خام، جداسازی باکتری­ها انجام شد (Chen و همکاران، 2017).

در مرحله بعد میزان توانایی تولید بیوسورفکتانت با روش­های آزمون پخش نفت، آزمون امولسیون کنندگی و آزمون پاشش قطره مورد بررسی قرار گرفت (Khan و همکاران، 2017). برای اندازه­گیری میزان فعالیت آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز، ابتدا باکتری­ها در محیط کشت عمومی کشت داده شدند.

پس از رشد، به محیط کشت معدنی BHB حاوی نفت­خام تلقیح و در شیکر انکوباتور به­مدت 48 ساعت C˚30 گرماگذاری شدند. عصاره خام آنزیمی حاوی آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژنازاز طریق شکستن غشای سلولی با استفاده از بافر لیز کننده (حاوی: Tris-HCl, Triton X-100, Tween 20) و دستگاه فراصوت استخراج گردید.

میزان فعالیت آنزیمی در عصاره سلولی پس از افزودن بافر فسفات 50 میلی­مولار و کاتکول 50 میلی­مولار از طریق قرائت مقدار افزایش جذب نمونه در 375 نانومتر، به مدت سه دقیقه اندازه­گیری شد (Guo و همکاران، 2015).

3- نتایج و بحث

با بررسی نتایج تجزیه واریانس مشخص شد که جدایه­های بدست آمده از لحاظ تولید بیوسورفکتانت و میزان جذب آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز در سطح احتمال یک درصد دارای تفاوت معنی­دار بودند. بررسی توان پخش کنندگی و پاشش قطره نفت خام نشان داد که نتایج این دو آزمایش باهم هم­بستگی دارند.

بیشترین مقدار پاشش قطره به جدایه­های  A34، A13 و کمترین به جدایه­های T16، A17، B3،  BN1،  E14 مربوط بود. همچنین بیشترین مقدار پخش نفت به جدایه A34 مربوط بود که توانست دایره­ای به قطر 78 میلی­متر در لایه نفتی موجود در سطح آب ایجاد کند.

جدایه­های A13 و A5 نیز به ترتیب با مقادیر 65، 31 میلی­متر پتانسیل قابل توجهی برای پخش نفت از خود نشان دادند. کمترین مقدار این ویژگی نیز در جدایه­های T16، A17، B3،  BN1،  E14 مشاهده شد (شکل 1).

ژانگ و همکاران (2012) نیز گزارش کردند که سویه­های جنس سودوموناس جداسازی شده از خاک آلوده به ترکیبات نفتی قادر به پخش لایه نفتی در سطح آب بودند که بالاترین میانگین بدست آمده در این تحقیق 45 میلی­متر بود.

سایپنیت و همکاران (2015) اعلام کردند که اندازه­گیری پخش نفت روشی مناسب برای شناسایی، بررسی کیفی و مقایسه تولید ترکیبات بیوسورفکتانتی می­باشد.

شکل 1 میزان پخش نفت و پاشش قطره جدایه­های بدست آمده از خاک­های آلوده به نفت خام

 

تجزیه واریانس قدرت امولوسیون کنندگی نفت خام نشان داد که جدایه­ها از این نظر در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی­داری با هم دارند.

بالاترین میزان امولوسیون کنندگی با 100 درصد در جدایه­های E11 و A17 مشاهده شد که به دنبال آن جدایه­های T16 و BN1 به ترتیب با میانگین 8/88 و 6/88 درصد قرار داشتند. پایین­ترین میانگین نیز در جدایه A34 مشاهده شد (شکل 2).

مقادیر مختلفی برای قدرت امولوسیون کنندگی باکتری­های مختلف توسط محققین گزارش شده است. بنتو و همکاران (2005)، میزان امولوسیون کنندگی برای باکتری جنس اسینتوباکتر را در حدود 74 درصد اعلام کردند، برین و همکاران (2014) نیز برای باکتری­های سودوموناس آئروجینوزا و باسیلوس سوبتیلیس میزان امولوسیون کنندگی را در حدود 60 درصد گزارش کردند.

شکل2 میزان امولوسیون کنندگی جدایه­های بدست آمده از خاک­های آلوده به نفت خام

بررسی فعالیت آنزیمی نشان داد جدایه T16 مقدار جذب نوری را در 375 نانومتر به میزان 798/0 افزایش داد که بیانگر فعالیت کاتکول 2،3دی­اکسیژناز است.

همچنین جدایه B3 نیز با میزان 327/0 جذب نوری در 375 نانومتر نیز نشان دهنده فعالیت کاتکول 2،3دی­اکسیژناز بود. اما در بقیه جدایه­ها اختلاف معنی­داری نسبت به هم مشاهده نشد.

شکل 3 میزان فعالیت آنزیم کاتکول 2،3دی­اکسیژناز براساس افزایش جذب نور

 

 در نهایت نتایج به­دست آمده نشان داد که جدایه­های جدا شده از خاک­های آلوده به نفت خام دارای پتانسیل متفاوتی هستند. در بررسی­ میزان تولید بیوسورفکتانت مشاهده شد که نتایج آزمایش­های پخش نفت و پاشش قطره به طور معنی داری باهم هم­بستگی دارند،

اما نتایج این دو آزمایش با نتایج آزمایش امولوسیون کنندگی اختلاف معنی داری دارد. در ضمن نتایج آزمایش امولوسیون کنندگی با میزان فعالیت کاتکول 2،3دی­اکسیژناز تا حدودی شباهت معنی داری، اما با نتایج آزمایش­های پخش نفت و پاشش قطره اختلاف معنی داری دارند.

4- منابع

Atlas, R. and Bragg, J., 2009. Bioremediation of marine oil spills: when and when not–the Exxon Valdez experience. Microbial biotechnology, 2(2), pp.213-221.

Barin, R., Talebi, M., Biria, D. and Beheshti, M., 2014. Fast bioremediation of petroleum-contaminated soils by a consortium of biosurfactant/bioemulsifier producing bacteria. International Journal of Environmental Science and Technology, 11(6), pp.1701-1710.

Bento, F. M., de Oliveira Camargo, F. A., Okeke, B. C., & Frankenberger, W. T. 2005. Diversity of biosurfactant producing microorganisms isolated from soils contaminated with diesel oil. Microbiological research, 160(3), 249-255.

Chen, W., Li, J., Sun, X., Min, J. and Hu, X., 2017. High efficiency degradation of alkanes and crude oil by a salt-tolerant bacterium Dietzia species CN-3. International Biodeterioration & Biodegradation, 118, pp.110-118.

Čipinytė, V., Grigiškis, S., Šapokaitė, D., & Baškys, E. 2015. Production of biosurfactants by arthrobacter sp. n3, a hydrocarbon degrading bacterium. In Environment. Technology. Resources. Proceedings of the International Scientific and Practical Conference (Vol. 1, pp. 68-75).

Guo, G., Fang, T., Wang, C., Huang, Y., Tian, F., Cui, Q. and Wang, H., 2015. Isolation and characterization of two novel halotolerant Catechol 2, 3-dioxygenases from a halophilic bacterial consortium. Scientific reports, 5, p.17603.

Haritash, A.K. and Kaushik, C.P., 2009. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): a review. Journal of hazardous materials, 169(1-3), pp.1-15.

Khan, A.H.A., Tanveer, S., Alia, S., Anees, M., Sultan, A., Iqbal, M. and Yousaf, S., 2017. Role of nutrients in bacterial biosurfactant production and effect of biosurfactant production on petroleum hydrocarbon biodegradation. Ecological Engineering, 104, pp.158-164.

Li  xinfei, Zhao  lin, Adam M., 2016. Biodegradation of marine crude oil pollution using a salt-tolerant bacterial consortium isolated from Bohai Bay, China. Mar Pollut Bull. 105:43–50.

Sohi, S.P., Krull, E., Lopez-Capel, E. and Bol, R., 2010. A review of biochar and its use and function in soil. In Advances in agronomy (Vol. 105, pp. 47-82). Academic Press.

Wang, H., Wang, C., Lin, M., Sun, X., Wang, C. and Hu, X., 2013. Phylogenetic diversity of bacterial communities associated with bioremediation of crude oil in microcosms. International Biodeterioration & Biodegradation, 85, pp.400-406.

Zhang, X., Xu, D., Zhu, C., Lundaa, T. and Scherr, K.E., 2012. Isolation and identification of biosurfactant producing and crude oil degrading Pseudomonas aeruginosa strains. Chemical Engineering Journal, 209, pp.138-146.

[1] Bushnell-Haas Broth

اشتراک:

درباره نویسنده

نظرات بسته اند

برچسب‌ها : % % % % % % % %
Call Now Button