مكانيسم تاثيرمهاري يون سرب بر فعاليت آنزيم لاكتوپراكسيداز- حسين طايفي نصرآبادي؛ میلاد بیده-

0

سرب یک فلز بسیار سمی است که بر همه بافت ها و سیستم های بدن موجودات زنده تاثیر گذار است. یکی از اصلی ترین دلایل سمیت آن نیز اختلال در عملکرد آنزیم ها است. در این تحقیق هدف بررسی اثر غلظت های مختلف یون سرب و همچنین بررسی تاثیر مدت زمان پری انکوباسیون مختلف یون سرب بر فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم لاکتوپراکسیداز  می باشد.

جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور یون سرب، ابتدا آنزیم در دو زمان انکوباسون مختلف (5 و 60 دقیقه) در معرض غلظت های مختلف یون سرب قرار گرفت سپس فعالیت آن با استفاده از دو سوبسترای ABTS و پراکسید هیدروژن در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری گردید. نتایج نشان داد که تاثیر غلظت های مختلف یون سرب در مدت زمان انکوباسیون مختلف تاثیرات مختلفی بر فعالیت و پارامتر های سینیتیکی آنزیم لاکتو پراکسیداز(Km وVmax) دارد. همچنین با افزایش مدت زمان انکوباسیون آنزیم لاکتوپراکسیداز با یون سرب نوع مهار آنزیمی نیز تغییر می نماید.

کلمات کلیدی: لاکتوپراکسیداز، سرب، سینتیک، مهار آنزیمی

  • مقدمه

سرب یک فلز بسیار سمی است که بر همه بافت ها و سیستم های بدن انسان تاثیر می گذارد. میزان آن در هوا 100 میلی گرم در هر متر مکعب می باشد که این مقدار برای سلامتی و زندگی خطرناک است (Rudolph et al. 2003). اغلب سرب خورده شده به جریان خون جذب می شود. علت اولیه و اصلی سمیت یون سرب دخالت در عملکرد طبیعی آنزیم ها است.

این کار عمدتا از طریق اتصال آن به گروه سولفیدریل موجود در بسیاری از آنزیم ها و یا تقلید و جابجایی با فلزات دیگر که در بسیاری از واکنش های آنزیمی به عنوان کوفاکتور عمل می کنند صورت می گیرد Dart, Hurlbut& Boyer-Hassen, 2004). از جمله فلزات ضروری که یون سرب در آنزیمها با آنها جایگزین می شود می توان به یون کلسیم ، آهن  و روی اشاره کرد (Kosnett, 2006). لذا بررسیها نشان داده است که سطح بالایی از یون کلسیم و یون آهن قادر به جلوگیری از مسمومیت با یون سرب می باشند (Luckey&Venugopal, 1979).

شیر دارای آنزیم های زیادی  می باشد که فعالیت ضد میکروبی دارند و از جمله مهم ترین آن ها می توان  به لاکتوپراکسیداز، لاکتوفرین، لیزوزیم و گزانتین اشاره کرد. این آنزیم ها سیستم های پیچیده ای برای غیر فعال سازی میکروارگانیسم‌ها دارند

(Brew, 2003). لاکتوپراکسیداز یک آنزیم ترشح شده در شیر می باشد که خاصیت اکسیدوردوکتازی دارد و در حفاظت از غدد شیری و مقاومت روده ای کودکان نیز نقش ایفا می کند (Brew, 2003).

در شیر سیستمی به نام لاکتوپراکسیدازی وجود دارد که متشکل از 3 جزء آنزیم لاکتوپراکسیداز، یون تیوسیانات و پراکسید هیدروژن  می باشد. وظیفه پراکسید هیدروژن اکسیداسیون یون تیوسیانات  در حضور آنزیم لاکتوپراکسیداز و تولید حدواسط های ضد باکتریایی است (De Wit & Van Hooydonk, 1996).

در این تحقیق هدف بررسی اثر غلظت های مختلف یون سرب و همچنین بررسی تاثیر مدت زمان پری انکوباسیون مختلف یون سرب بر فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم لاکتوپراکسیداز  می باشد.

  • مواد و روشها

لاکتوپراکسیداز بطور جزیی از شیر گاو تخلیص گردید، جهت این کار ابتدا نمونه های شیر بوسیله سانتریفیوژ چربی زدایی گردید سپس جهت رسوب پروتیین کازیین شیر، pH  شیر از 6 به 7/4 pH) نقطه ایزوالکتریک کازیین) کاهش داده شد. پس از سانتریفیوژ نمونه های حاصله، محلول رویی به عنوان منبع آنزیمی مورد استفاده قرارگرفت.

جهت اندازه گیری فعالیت آنزیمی از سوبستراهای ABTS و پراکسیدهیدروژن استفاده شد. تغییرات جذب در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری گردید. جهت بررسی اثر همزمان غلظت و مدت زمان انكوباسيون يون سرب بر فعاليت آنزيم لاكتوپراكسيداز، ابتدا آنزيم به ترتيب در مدت زمان 5 و 60 دقيقه در تيوب مخصوص در معرض غلظت هاي مختلف يون سرب قرار گرفت و سپس فعاليت آن در طول موج 412 نانومتر اندازه گيري شد.

جهت محاسبه یKm  و Vmax آنزیم لاکتوپراکسیداز فعالیت آنزیم در حضور غلظت های متغییر ABTS و غلظت ثابتی از پراکسیدهیدروژن  اندازه گیری شد. سپس با استفاده از نمودار میکائیلیس – منتن  و با برنامه sigmaplot پارامتر های مورد نظر محاسبه گردید.

3- نتايج و بحث

نمودار بررسي اثر غلظت هاي مختلف يون سرب در دو زمان پري انكوباسيون 5 دقيقه و 60 دقيقه بر فعاليت آنزيم لاكتوپراكسيداز  در شكل 1 نشان داده شده است.

شكل 1- تاثير همزمان غلظت و مدت زمان پري انكوباسيون يون سرب بر فعاليت آنزيم لاكتوپراكسيداز.

همانطور که در شکل 1 نمایش داده شده است فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز با افزایش غلظت یون سرب کاهش چشمگیری نشان می دهد. برای مثال در غلظت 20 میلی مولار از یون سرب میزان فعالیت آنزیم پس از 5 دقیقه انکوباسیون 22 درصد نسبت به کنترل (در غیاب یون سرب) کاهش یافته درحالیکه در غلظت 80 میلی مولار یون سرب با همین مدت زمان انکوباسیون فعالیت آنزیم 55 درصد کاهش نشان می دهد. علاوه بر این با مقایسه زمان پری انکوباسیون آنزیم پس از 5 دقیقه و 60 دقیقه با یک غلظت ثابت از یون سرب،  با افزایش زمان انکوباسیون تاثیر مهاری بیشتری بر فعالیت آنزیم مشاهده می گردد.

مثلا در غلظت 40 میلی مولار از یون سرب فعالیت آنزیم پس از 5 دقیقه انکوباسیون به میزان 56 درصد کاهش یافته ولی در همان غلظت 40 میلی مولار از یون سرب پس از گذشت 60 دقیقه انکوباسیون میزان کاهش فالیت به 73 درصد رسیده است. این پدیده نشان دهنده مکانیسم وابسته به زمان اثر یون سرب بر فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز می باشد.

شکل 2 بترتیب رابطه میزان غلظت سوبسترای ABTS و فعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز در حضور غلظت 20 میلی مولار یون سرب را پس از مدت زمان پری انکوباسیون 5 و 60 دقیقه را جهت محاسبه پارامترهای Km و Vmax آنزیمی نشان می دهد.

 

شکل 2-نمودار هایپر بولیک آنزیم لاکتوپراکسیداز A) پس از 5 دقیقه و B) پس از 60 دقیقه پری انکوباسیون با غلظت 20 میلی مولار از یون سرب.

جدول 1 مقادیر محاسبه شده پارامترهای Km و Vmax آنزیم لاکتوپراکسیداز در غیاب و در حضور غلظت 20 میلی مولار یون سرب در دو زمان پری انکوباسیون 5 دقیقه و 60 دقیقه را نشان می  دهد.

جدول 1- مقادیر پارامترهای سینتیکی آنزیم لاکتوپراکسیداز در غیاب و در حضور غلظت 20 میلی مولار یون سرب در دو زمان پری انکوباسیون 5 دقیقه و 60 دقیقه. 

پری انکوباسیون min60 پری انکوباسیون min5
Km (mM)         Vmax (OD/min) Km (mM)       Vmax (OD/min) [pb2+]mM
601/0 131/0 601/0 131/0 0
30/0 80/0 601/0 454/0 20

طبق این جدول مقادیر  پارامتر Km آنزیم در غیاب ( غلظت صفر) و حضور یون سرب (20 میلی مولار) پس از 5 دقیقه پری انکوباسیون از 131/0 میلی مولار به 454/0 میلی مولار افزایش یافته اما مقدار Vmax آن تحت این شرایط ثابت مانده است. این حالت بیانگر مهار غیر رقابتی آنزیم لاکتوپراکسیداز توسط یون سرب پس از  5 دقیقه انکوباسیون  می باشد. بطور جالب پس از 60 دقیقه پری انکوباسیون آنزیم با غلظت 20 میلی مولار یون سرب، هم پارامتر Km و هم پارامتر Vmax  آنزیم نسبت به کنترل تغییر نموده است.

Km آنزیم نسبت به کنترل افزایش و Vmax آنزیم نسبت به کنترل کاهش نشان می دهد. این حالت بیانگر مهار مخلوط یا  Mixed inhibition آنزیم لاکتو پراکسیداز توسط یون سرب پس از 60 دقیقه پری انکوباسیون با یون سرب است. لذا با افزایش مدت زمان پری انکوباسیون آنزیم با یون سرب، نوع مهار آنزیمی از نوع غیر رقابتی به نوع مخلوط تغییر یافته است. نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد که یون سرب با اتصال آهسته به آنزیم لاکتوپراکسیداز بتدریج با گذشت زمان باعث کاهش بیشتر فعالیت این آنزیم شده و  از طرف دیگر تغییر نوع مهار آنزیمی از نوع غیر رقابتی به نوع مخلوط بیانگر تغییر کانفورماسیون آنزیم با گذشت زمان در حضور یون سرب می باشد.

قدرداني

از حمايت هاي مالي دانشگاه تبريز تشكر و قدرداني مي گردد.

منابع

Dart, R. C.; Hurlbut, K. M.; Boyer-Hassen, L. V. (2004).”Lead”. In Dart, R. C. Medical Toxicology (3rd ed.). Lippincott Williams & Wilkins.p. 1426.ISBN 978-0-7817-2845-4.

De Wit, J.N., & van Hooydonk, A.C.M. (1996). Structure, functions and applications of lactoperoxidase in natural antimicrobial systems: Netherlands Milk and Dairy Journal, 50: 227-244.

Kosnett, M. J. (2006). “Lead”. In Olson, K. R. Poisoning and Drug Overdose (5th ed.). McGraw-Hill Professional.p. 238.ISBN 978-0-07-144333-30.

Luckey, T. D.; Venugopal, B. (1979).Physiologic and Chemical Basis for Metal Toxicity.Plenum Press.ISBN 978-1-4684-2952-7.

Rudolph, A. M.; Rudolph, C. D.; Hostetter, M. K.; et al. (2003).”Lead”. Rudolph’s Pediatrics(21st ed.). McGraw-Hill Professional.p. 369. ISBN 978-0-8385-8285-5.

Rudolph, A. M.; Rudolph, C. D.; Hostetter, M. K.; et al. (2003).”Lead”. Rudolph’s Pediatrics (21st ed.). McGraw-Hill Professional.p. 369.ISBN 978-0-8385-8285-5.

اشتراک:

درباره نویسنده

نظرات بسته اند

برچسب‌ها : % % % % % % % % % % % %